在PCR扩增实验中应注意什么？

2025-02-19 15:54:23

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回答1：

1. 引物的质量是保证PCR特异性的关键，引物过长或过短均会使特异性降低，以18～30bp为宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物内部和引物之间不应含有互补序列；引物的碱基顺序与非扩增区域的同源性应小于70%；引物的3’末端与模板DNA一定要配对，但末端没有严格的限制，故引物设计时可在5’末端加上限制性内切酶位点和/或启动密码ATG等；引物合成后必须纯化以去除合成产物中的不完整序列、脱嘌呤产物、碱基修饰链等“杂质”；引物的终浓度一般为0.2～0.5μmol/L，过低会影响反应产量，过高会增加引物二聚或错配的几率。
2. Taq DNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但无3’-5’外切酶活性，因此对单核苷酸的错配无校正功能，发生碱基错配的几率为 2.1×10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的优势在于反应产量高于其他DNA聚合酶。Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人员心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶经基因工程改造后，新创出的Pfu Ultra具有更佳的校验活力。数据显示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均错配率为Pfu DNA聚合酶的1/3，为Taq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶(保真度＝1/错误率) (数据来源：美国冷泉港实验室)。
3. Mg2+浓度也是影响反应效率和特异性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶对Mg2+浓度非常敏感，Mg2+可与模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根结合，不同反应体系中应适当调整MgCl2的浓度，一般以比 dNTP总浓度高出0.5～1.0mmol/L为宜，Mg2+过量能增加非特异扩增。
4. dNTP的浓度过高会增加碱基的错误掺入率，使反应特异性下降；过低则会导致反应速度下降。使用时4种dNTP必须以等当量浓度配制，均衡的dNTP有利于减少错配误差和提高使用效率。
5. 温度循环参数中应特别注意复性温度，它决定引物与模板的特异性结合。退火复性温度可根据引物的长度，通过Tm＝4(G+C)+2(A+T) 计算得到。在Tm允许的范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物与模板之间的非特异结合。
6. 减低污染的常规措施：①将PCR试剂、PCR产物及其他分子生物学试剂分开放置；②应保持样品制备、PCR反应液配制与PCR产物分析三个工作区的独立性；③使用阳性和阴性对照；④使用最高质量的水配制PCR实验的所有反应试剂；⑤配制好的PCR反应试剂应分成小包装储存，每个包装仅用于单次实验；⑥制备样品、配制试剂及反应液时必须戴手套；⑦实验前一定要认真清洁加样器等。

回答2：

以前反应产生的气溶胶会成为副反应模板，必须出去，通常使用识别dUTP的内切酶除去外来的模板

注意模板的纯度，通常DNA，RNA，甚至单个细胞都是可以作为模板的，但DNA的纯度可以达到很好，而RNA次之，细胞的非特异性很多，建议使用DNA模板

酶需要用高保真和高速率的，推荐taq系列的，1kbp左右的速率，实验室常用
引物的设计，通常在20~30bp之间，退火温度50℃~60℃，设计时保证引物的特异结合，减少非特异结合

回答3：