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(1)培养基原材料预湿是否均匀 在采用蒸汽灭菌时,是靠水蒸气的温度和穿透能力达到灭菌的。水分热传导性能比许多固体培养基(木屑、粪草等)的热传导性能好,如果培养基预湿适度均匀,在灭菌过程中温度传递较容易达到均匀;如果培养料预湿不透,仅在料面形成一层水膜,而蒸汽又不能穿透到培养料的干燥处,那么就达不到彻底灭菌的效果。因此在培养基配料过程中块状培养基(木块、种木、粪块)应捣碎,水分均匀浸透。
(2)培养基的酸碱度 在培养基含有水的情况下,pH对培养基的灭菌效果有较大的影响。由于氢离子对细胞壁水解和对细胞质中碱基的亲合作用,促成生理反应加剧,加快细胞生命的停止。因此,偏酸性的培养基可以比中性或微碱性的培养基灭菌时间短。
(3)培养基营养成分 在培养基成分中,糖、脂肪和蛋白质的存在对微生物有一定的保护作用。特别是浓度较高的有机营养物质,当其表面受热变性后能形成一层保护膜影响热的传导,从而提高微生物的耐热性。但这种耐热性同浓度(即基质中含水量)有关,相反,无机盐、碱、酸等则可以削弱微生物的耐热性,这同提高微生物细胞壁的导热性能有关系。
作为培养食用菌的原料,通过灭菌既要达到无菌状态,又要保持营养成分少破坏。在灭菌过程中要处理好温度、压力和时间的关系,可以根据在高温条件下微生物死亡比有机物破坏来得快的特性,提高灭菌温度,缩短灭菌时间,达到既无菌又保护营养的目的。细菌抗热致死温度和时间关系见表2。
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表2 细菌抗热致死温度和时间的关系
(4)灭菌方式和灭菌锅(灶)的容量 食用菌制种、制袋生产中,培养料(基)灭菌可在高压灭菌锅、常压灭菌锅(灶)中进行。常压灶灭菌时间长,耗能大,但制作容易,技术和材料要求低。高压灭菌设备须按有关压力容器要求选材和凭证制造检验,成本高,但灭菌时间短,效率高,比常压灭菌彻底。根据实践经验,固定常压灭菌灶每次灭菌以1000~2000袋的容量为宜,灭菌灶体积小,灶内升温快,培养基内微生物可自繁时间短,培养基内pH降低少,灭菌效果更有把握。高压灭菌只要锅炉蒸汽量与锅仓体积相适应即可,但蒸汽送气口的挡气板应当随着进汽管口直径的增大而增大,使蒸汽进入锅内大面积扩散,这样可减少菌瓶菌袋棉塞受潮,防止污染。
(5)灭菌锅(灶)内培养基的堆叠方式 锅内菌瓶或菌袋排列形式对灭菌效果影响大,因为塑料袋受热后变软,若采用堆柴片式堆叠,在加温时菌袋之间可能紧贴形成一体,使直径不足10厘米的菌袋,变成直径几十厘米甚至更大的“菌袋”,导致热传导由表到里的路程变远,结果延长灭菌时间,影响灭菌效果。菌瓶由于外壁是坚硬的玻璃,瓶与瓶之间有间隙,以致蒸汽较易使各瓶均匀受热。如果把菌袋改为“井”字形排列,每3~4层以层板相隔开后再往上架叠,这样容易使蒸汽正常对流,锅(灶)内温度均匀,穿透培养基较容易,能取得较好的灭菌效果。有的栽培者为了达到突击生产的目的,不顾锅(灶)容量,柴片式过量堆叠菌袋,其结果不仅灭菌时间拉长,而且效果也不理想。活动式灭菌灶,容积可达3000~5000筒,周围应使用周转筐装袋,中部用“井”字型排放。
(6)灭菌锅(灶)内的温度与压力 高压灭菌锅衡量灭菌效果是通过压力表和温度计。湿热蒸汽灭菌的香菇一级种培养基,要求1.08×105帕的压力,木屑培养基要求1.47×105帕的压力,这时锅内温度在121~126℃并维持时间1.5~2小时。在实际操作中,经常发现灭菌不过关的原因是冷空气排除不干净。排除冷空气有两种方法,一种是先关闭气阀,当压力上升到4.9×104帕,再打开气阀排除冷空气。这种方法要注意棉塞用牛皮纸和棉线扎紧,防止排气减压时,棉塞冲出试管口或瓶口;二是从加温开始就打开气阀,当气阀出口蒸汽直立冲出、气温较高时才关闭阀门,进入灭菌状态。
常压灭菌时无排气问题,但要注意常压灭菌灶结构对气流温度的影响,方形灶内一般靠近盛水锅的4个边角气温最低,在建灶时,沿着锅沿把四个角落砌成圆形,以便灶内均衡升温,达到同步灭菌的目的。常压灭菌温度越高,灭菌所需时间越短,微生物死亡时间与灭菌所需时间关系见表3。
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表3 常压灭菌的微生物致死时间
灭菌法,杀灭一切微生物,物理法,热力,辐射,微波,等离子体,化学法,醛类,烷化剂
高效消毒法,杀灭一切致病微生物,紫外线,含氯剂,臭氧,复配剂
中效消毒法,杀灭除芽孢外的致病微生物,超声波,碘类,醇类,酚类
低效消毒法,杀灭细菌繁殖体,亲脂病毒,单链季胺盐,双胍类,中草药,金属离子
消毒方法,
100度煮沸5-6分钟
巴氏消毒法
用75%酒精进行皮肤消毒
氯气消毒水源
紫外线消毒
灭菌方法,
灼烧灭菌
干热灭菌
高压蒸汽灭菌
操作程序
器具的灭菌
培养基的配制
培养基的灭菌
倒平板
微生物接种
恒温箱中培养
菌种的保存
影响培养基灭菌的因素有一下几点:
1、培养基的内容,根据培养基所含物质的不同,需要相应的选择不同的灭菌温度,比如糖类含量较多的时候最好选用115℃,30分钟;一般的培养基可选择121℃20分钟。
2、灭菌锅内空气是否排净,这个是影响灭菌是温度和压力比例关系的要点,同样达到了相同的压力的情况下,如果空气未能排净,也就是说不是纯蒸汽灭菌,此时的温度不一定能达到目的要求,严重影响灭菌效果。
3、灭菌时间,根据不同的物品要选择相应的灭菌时间,短了肯定是不行,过长又浪费资源。
4、灭菌完成除特殊要求之外,要自然降温降压,不易强行放气降压,这样也会影响灭菌效果。
温度,压力,灭菌时间
温度一般是121摄氏度,压力我忘了,反正是高压。灭菌时间一般式20分钟。如果温度不够,压力不够,时间不够,都会影响灭菌
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