如何证明外源基因已在宿主细胞中表达

2025-02-13 02:56:47

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回答1：

如何证明外源基因已在宿主细胞中表达
影响外源基因高效表达的各种因素：
一、外源基因的表达效率
①启动子的强弱。有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞中高效表达的关键步骤之一，也可以说，转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤。因此，选择强的可调控启动子及相关的调控序列，是组建一个高效表达载体首先要考虑的问题。
最理想的可调控启动子应该是：在发酵的早期阶段表达载体的启动子被紧紧地阻遏，这样可以避免出现表达载体不稳定，细胞生长缓慢或由于产物表达而引起细胞死亡等问题。当细胞数目达到一定的密度，通过多种诱导(如温度、药物等)使阻遏物失活，RNA聚合酶快速起始转录。
②核糖体结合位点的有效性。SD 序列是指原核细胞 mRNA 5`端非翻译区同 16S rRNA 3`
端的互补序列。按统计学的原则，一般 SD 序列至少含 AGGAGG 序列中的 4 个碱基。SD 序列的存在对原核细胞 mRNA 翻译起始至关重要。
③SD 序列和起始密码子 AUG 的间距。AUG 是最首选的起始密码子，GUG、UUG、AUU 和AUA有时也用作起始密码子，但非最佳选择。另外，SD 序列与起始密码子之间的距离以 9±3 为适宜。
④密码子组成。尽量避免使用罕用密码子如：AGG、AGA(Arg)、CUA(Leu)等。
二、表达质粒的拷贝数和稳定性：
多数情况下，目标基因的扩增程度同基因表达成正比，所以基因扩增为提高外源基因的表达水平提供了一个方便的方法。对于原核和酵母表达体系而言，选择高拷贝数的质粒，以其为基础，组建表达载体。表达载体的稳定性是维持基因表达的必需条件，而表达载体的稳定性不但同表达载体自身特性有关，也与受体细胞的特性密切相关。所以在实际运用时，要充分考虑两方面的因素而确定好的表达系统。利用选择压力、尽量减少表达载体的大小、通过建立可整合到染色体中去的载体等待方式，可以增加表达质粒的稳定性。
三、表达产物的稳定性：
①组建融合基因，产生融合蛋白。融合蛋白的载体部分通过构象的改变，使外源蛋白不被选择性降解。这种通过产生融合蛋白表达外源基因，特别是相对分子质量较小的多肽或蛋白编码的基因，尤为合适。
②产生可分泌的蛋白。如将外源基因表达产物分泌到大肠杆菌细胞的周质或直接分泌到培养基。
③外源蛋白可以在宿主细胞中以包涵体形式表达，这种不溶性的沉淀复合物可以抵抗宿主细胞中蛋白水解酶的降解，也便于纯化。
④选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞，有可能减弱表达产物的降解。
⑤采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性。
四、工程菌的培养条件：
由于细菌在100L以上的发酵罐中的生长代谢活动与实验室条件下200mL摇瓶中的生长代谢活动存在很大差异，在进行工业化生产时，工程菌株大规模培养的优化设计和控制对外源基因的高效表达至关重要。优化发酵过程既包括工艺方面的因素也包括生物学方面的因素。工艺方面的因素如选择合适的发酵系统或生物反应器，目前应用较多的有罐式搅拌反应器、鼓泡反应器和气升式反应器等。生物学方面的因素包括多方面，首先是与细菌生长密切相关的条件或因素，如发酵系统中的溶氧、pH 值、温度和培养基的成分等，这些条件的改变都会影响细菌的生长及基因表达产物的稳定性。生物因素的第二方面是对外源基因表达条件的优化。在发酵罐内工程菌生长到一定的阶段后，开始诱导外源基因的表达，诱导的方式包括添加特异性诱导物和改变培养温度等。使外源基因在特异的时空进行表达不仅有利于细胞的生长代谢，而且能提高表达产物的产率。生物因素的第三方面是提高外源基因表达产物的总量。外源基因表达产物的总量取决于外源基因表达水平和菌体浓度。在保持单个细胞基因表达水平不变的前提下，提高菌体密度可望提高外源蛋白质合成的总量。
五、细胞的代谢负荷：
外源基因在细菌中高效表达，必然影响宿主的生长和代谢，而细胞代谢的损伤，又必然影响外源基因的表达。合理地调节好宿主细胞的代谢负荷与外源基因高效表达的关系，是提高外源基因表达水平不可缺少的一个环节。

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