基因工程中重组质粒怎么形成

在基因工程中，通常是把外源DN***断利用运载工具送入生物细胞。携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫做载体(Vector)。

载体的本质是DNA。经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连接，导入受体细胞，还能利用本身的调控系统，使外源基因在新细胞中复制以致功能的表达。目前，将外源基因运送到原核生物细胞的载体研究的较多，运送到植物和动物细胞中去的载体还处于探索阶段。本章以原核细胞载体为主，讨论各类载体的结构、功能以及构建过程。

在基因工程中所用的载体，主要有5类，

(1) 质粒(Plasmid)，主要指人工构建的质粒。

(2) 噬菌体的衍生物。

(3) cosmid(柯斯质粒)。

(4) 单链DNA噬菌体M13。

(5) 动物病毒。

各类载体的来源不同，在大小、结构、复制等方面的特性差别很大，但作为基因工程用的载体，以下三方面是它们共有的特性和基本要求： (1)在宿主细胞中能独立自主的复制，即本身是复制子。(2)容易从宿主细胞中分离纯化。(3)载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，插在其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行复制和扩增。各类载体具有自己独特的生物学特性，可以根据基因工程的需要，有目的的选择合适的载体，为此，分别介绍各类载体。

一、质粒载体

质粒是一种裸露的，比病毒更简单的，有自主复制能力的DNA分子，是处于生命与非生命的分界线

(一) 质粒的一般生物学特性

质粒（plasmid)是染色体以外能自主复制的双链闭合环状DNA分子，它广泛存在于细菌细胞中。在霉菌、蓝藻、酵母和不少动植物细胞中也发现有质粒存在。目前对细菌质粒研究的较为深入，在基因工程中，多使用大肠杆菌质粒为载体。质粒分子的大小为1—200kb，质粒和病毒不同，它是裸露的DNA分子，没有外壳蛋白，在基因组中，也没有溶菌酶基因。质粒可以‘友好”的“借居”在宿主细胞中，也只有在宿主细胞中，质粒才能完成自己的复制。同时将其编码的一些非染色体控制的遗传性状进行表达，赋予宿主细胞各种有利的表型。

1．质粒的类型

在大肠杆菌中现已找到许多类型的质粒，其中对F质粒，R质粒和Col质粒研究的较为清楚。由于这些质粒的存在，寄主细胞获得了各自不同的性状特征。简介如下：

F质粒：又叫F因子或性质粒(sex plasmid)。 F因子是雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，与此相应的F—细胞则叫做雌性细胞。F+细胞的表面可以形成一种叫做性须(pilus)的结构，它促进雄性细胞同雌性细胞进行配对。在合适的条件下，将雄性细胞和雌性细胞混合培养，由于性须的作用，就会形成雌—雄细胞配对。我们称这种过程为细菌的接合作用(conjugation)。在雌雄细胞配对期间，雄性细胞中的F因子按滚环复制模式，经性须作用进入到雌性细胞。配对之后F—受体细胞获得了F因子，也变成为F+细胞。

F因子不但能够通过接合作用实现自我转移，而且还能够带动寄主染色体一道转移。由F因子整合到染色体而成的Hfr细胞（高频重组细胞），就有可能引发寄主染色体发生高频转移。但F因子的这种整合作用是一种可逆的过程，因此在一定的条件下，Hfr细胞又可重新变成F+或F细胞。

R质粒：也称抗药性因子。R质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因，此种抗性通常能转移到缺乏该质粒的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力

Col质粒：此类质粒编码有控制大肠杆菌素合成的基因，即所谓产生大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是一种毒性蛋白，它可以使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。

根据质粒DNA中是否含有接合转移基因，可以分成两大类群:即接合型质粒和非接合型质粒。接合型质粒亦称自我转移的质粒，这类质粒除含有自我复制基因外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因，如F质粒，部分R质粒和部分Col质粒。非接合型质粒亦称不能自我转移的质粒，此类质粒能够自我复制，但不含转移基因组，因此这类质粒不能从一个细胞自我转移到另一个细胞。从基因工程的安全角度讲，非接合型质粒用作克隆载体更为合适。

2．质粒的复制类型

一种质粒在一个细胞中存在的数目，称为质粒的拷贝数。根据宿主细胞所含拷贝数的多少，可把质粒分成两种不同的复制型。一种是低拷贝数的质粒，称“严紧型”复制控制的质粒(stringent plasmid)，此类质粒每个宿主细胞仅含1～3份的拷贝。另一类是高拷贝数的“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)，这类质粒每个宿主细胞可达到10～60份拷贝。

一种质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并不是绝对的，这往往同宿主的状况有关。同一质粒在不同的宿主细胞中可能具有不同的复制型，这说明质粒的复制不仅受自身的制约，同时还受到宿主的控制。

在一般情况下，质粒的接合转移能力与复制型及分子大小间有一定的相关性。现归纳如下：

分子量大 分子量小

接合型质粒 拷贝数少 非接合型质粒 拷贝数多

严紧型复制 松弛型复制

3．质粒的不亲和性

在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存，这一现象称为质粒的不亲和性(plasmid incompatibility)，也称不相容性。例如colEI派生质粒，它们之间是互不相容的，也就是说，这些亲缘关系较近的不同质粒，当两种进入同一细胞后，必定有一种在细胞的增殖过程中，被逐渐排斥(稀释)掉。称这些质粒间是不相容的。

彼此不相容的质粒属于同一个不亲和群Gneompatiblity group)。而彼此能够共存的亲和质粒，则属于不同的不亲和群。大肠杆菌质粒现已鉴别出25个以上的不亲和群。它们之间是相容的，而同一个不亲和群内的质粒是不相容的。

(二) 质粒载体的基本条件

以上讨论的都是天然质粒，天然质粒的研究在理论上和遗传学等方面作出了贡献，但它很难直接作为基因工程的运载体应用。质粒载体绝大多数是以天然质粒为基础，人工改造和组建形成的实用载体。可根据不同的实验要求，加以选择。

作为理想的质粒载体，应具备以下几个条件：

(1) 能自主复制，即本身是复制子

(2) 具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；

(3) 在基因组中有1—2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征。

(4) 分子量要小，多拷贝，易于操作。

二、 大肠杆菌质粒载体

1．pBR322质粒

质粒pBR322是经人工构建的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体，亦是应用最为广泛的克隆载体，利用pBR322曾克隆到多种基因，虽然现在已有多种具有更优良特性的新型克隆载体逐渐代替了pBR322在基因克隆中地位，但pBR322仍是人工构建的具有几乎所有的理想特性的基因克隆载体之一。pBR322质粒是按照标准的质粒载体命名法则命名的。“p”表示它是一种质粒；而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F．Bo1ivar和R．L．Rodriguez姓氏的头一个字母，“322'’系指实验室编号，以与其他质粒载体如pBR325，pBR327，pBR328等相区别。当然，“BR"恰好与“细菌抗药性”(bacterialresistance)两个词的第一个字母等同，所以有不少人认为pBR322中的"pBR"是“细菌抗药性质粒”的英文缩写。这显然是一种容易使人信以为真的猜想，而事实上只是一种有趣的巧合。

（1）pBR322质粒的结构

pBR322的图谱:

从pBR322质粒的构建过程，可以知道它是由三个不同来源的部分组成的，

第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（ampr）；

第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）；

第三部分来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。

（2）pBR322质粒载体的优点

pBR322质粒载体的第一个优点是具有较小的分子量。为了方便起见，大家统一规定pBR322质粒DNA分子核苷酸的计数从EcoRI限制酶的识别位点开始，并公认该序列…GAATTC…中的第一个T为核苷酸1(图4—23)，然后沿着从tetr基因到ampr基因按顺时针方向顺序计数。因此pBR322质粒DNA分子的正确长度是4 363bp。

pBR322质粒载体的第二个优点是，具有两种抗菌素抗性基因可供作挂化子的选择记号。现在已知总共有24种核酸内切限制酶对pBR322DNA分子都只具有单一的识别位点。其中有7种限制酶：EcoRV, NheI, BamHI, SphI, SalI, XmaIII和NruI，它们的识别位点是位于四环素抗性基因内部，另外有2种限制酶:ClaI和HindIII的识别位点是存在于这个基因的启动区内，在这9个限制位点上插入外源DNA都会导致tetr基因的失活；还有3种限制酶(ScaI、PvuI和PstI)在氨苄青霉素抗性基因（ampr）内具有单一的识别位点，在这个位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活。这种因DNA插入而导致基因失活的现象，称之为插入失活效应。

质粒DNA编码的抗菌素抗性基因的插入失活效应，是检测重组体质粒的一种十分有用的方法。例如，将外源DN***段克隆在pBR322质粒的BamHI或SalI位点上，由于阻断了tetr基因编码序列的连续性，而使其失去活性，结果便产生出了具有AmprTetr表型的重组的pBR322质粒。将这样的重组质粒转化给野生型(AmpSTetr)的大肠杆菌细胞，并涂布在含有氨苄青霉素的选择性培养基平板上。那么存活下来的菌落都将具有Ampr的表型，因此它们也必定是获得了编码有这种抗性基因的质粒的转化子克隆。但在这些Ampr表型的转化子克隆中，有一部分具有Tetr表型，另一部分具有Tets的表型。只要将它们涂布在含四环素的选择性培养基平板上，就可以迅速地辨别出它们到底属于什么表型。因为在tetr基因内没有插入外源DN***段的pBR322质粒，其tetr基因是有活性的，由它转化来的Ampr转化子菌落就应该是Tetr的表型，所以AmprTets表型的细胞所携带的pBR322，必定是在其tetr基因上插入了外源DNA的pBR322派生的重组质粒。

pBR322质粒载体的第三个优点是，具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。这就为重组体DNA的制备提供了极大的方便。

2．pUC质粒载体

pUC载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5，—端带有一段多克隆位点的lacZ'基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。

(1) pUC质粒载体的结构

此类质粒载体之所以取名为pUC，是因为它是由美国加利福尼亚大学University of California的科学家J．Messing和J．Vieria于1987年首先构建的。

一种典型的pUC系列的质粒载体，包括如下四个组成部分：

（a）来自pBR322质粒的复制起点(ori)；

（b）氨苄青霉素抗性基因(ampr)，但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点；

(c) 大肠杆菌β—半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α—肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ'基因；

（d）位于lacZ'基因中的靠近5”端的一段多克隆位点(MCS ，multiple cloning sites)区，但它并不破坏该基因的功能(图)。(2)pUC质粒载体的优点

与pBR322质粒载体相比，pUC质粒载体系列具有许多方面的优越性，是目前基因工程研究中最通用的大肠杆菌克隆载体之一。其优点概括起来有如下三个方面：

第一、 具有更小的分子量和更高的拷贝数

在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，使其分子大小相应地缩小了许多，如pUC8为2 750bp，pUCl8为2 686bp。同时，由于偶然的原因，在操作过程中使pBR322质粒的复制起点内部发生了自发的突变，导致rop基因的缺失。由于该基因编码的共63个氨基酸组成的Rop蛋白质，是控制质粒复制的特殊因子，因此它的缺失使得pUC质粒的拷贝数比带有pMBl或ColEl复制起点的质粒载体都要高得多，平均每个细胞即可达500～700个拷贝。所以由pUC质粒重组体转化的大肠杆菌细胞，可获得高产量的克隆DNA分子。

第二，适用于组织化学方法检测重组体

pUC质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ，基因，在这个基因的编码区中插入了一个多克隆位点。lacZ，基因所编码的α—肽链（编码β—半乳糖酶基因的氨基末端）可参与α—互补作用。这种载体适合于可编码β—半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。虽然质粒和宿主编码的片段各自均无活性，但它们共处一个细胞中时可融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质。这样，LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的β—半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种互补现象叫做α—互补。由α—互补而产生的Lac+细菌易于识别，在诱导物异丙基—β—D—硫代半乳糖苷(IPTG)存在时，它们在含有生色底物5—溴—4—氯—3—吲哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)的平板上形成蓝色的菌落。当多克隆位点中插入外源DN***段时，互补作用遭到破坏，在含有IPTG和X-gal平板上将出现白色菌落。利用“α—互补”进行重组子的筛选比利用“插入失活”法更加方便。应用pBR322质粒作克隆载体，其重组体转化子克隆的选择则需经过两个步骤，即还需从头一种抗性平板转移到另一种抗性平板。由此可见，使用pUC质粒载体进行基因克隆要比pBR322节省时间。

第三，具有多克隆位点MCS区

pUC质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点，它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。因此，克隆在MCS当中的外源DN***段，可以方便地从pUC质粒载体转移到M13mp8载体上，进行克隆序列的核苷酸测序工作。同时，也正是由于具有MCS序列，可以使具两种不同粘性末端(如EcoRI和BamHI的外源DN***段，无需借助其它操作而直接克隆到pUC质粒载体上。

3. pGEM系列载体

pGEM系列载体是一种与pUC系列十分类似的小分子的质粒载体。在其总长度为2 743bp的基因组DNA中，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ'基因。在后者还插入了一段含多个限制性内切酶的识别序列的多克隆位点。此序列结构几乎与pUC克隆载体的完全一样。

pGEM系列载体与pUC系列之间主要差别是，它具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。由于这两个启动子分别位于lacZ'基因中多克隆位点区的两侧(见图)，故若在反应试管中加入纯化的T7或SP6RNA聚合酶，那么克隆的外源基因便会转录出相应的mRNA。

三、λ噬菌体载体

l．λ噬菌体的一般生物学特性

λ噬菌体为线形双链DNA分子，长度约为49kb，在λDNA分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端，当λ噬菌体进入细菌细胞后，其DNA可迅速通过粘性末端配对而成双链环状DNA分子，这种由粘性末端结合形成的双链区域称为cos位点。

λ噬菌体是一个温和噬菌体，其生活周期有二种不同的类型，即裂解周期和溶源性周期。在裂解周期中，λ噬菌体的DNA分子一旦注入寄主细胞中，便可借助于寄主的复制和转录系统的功能，使自身DNA大量复制同时合成大量的外壳蛋白，并组装成大量(约100个)完整的噬菌体颗粒，最后，使宿主裂解并从细胞中释放出来。

在溶源周期中，λ噬菌体的DNA分子进入宿主后并不马上复制，而是在特定的位点整合到宿主染色体DNA中，与宿主染色体形成一体，并随宿主染色体的复制而复制，随宿主的分裂繁殖传给其子代细胞。

λDNA至少包括61个基因，除少数例外，大多数编码基因均是按功能的相似性成簇排列。值得注意的是，在入λDNA分子中从J基因到N基因之间，大约占λDNA总长度三分之一的区段对于λ噬菌体的裂解周期而言是非必需的。这一区段的缺失或在此段插入外源DN***段，将不影响入噬菌体的增殖。这就是λ噬菌体可作为基因工程载体的一个重要的依据。

2．λ噬菌体载体

（1）改造

野生型的λ噬菌体不适于直接用作基因克隆的载体。主要原因有二：

①λDNA基因组大而且复杂，特别是其中具有许多基因克隆常用的限制酶识别位点(如5个BamHI位点、6个BglⅡ位点和5个EcoRI位点等)；

②λ噬菌体外壳只能接纳一定长度(即相当于入基因组大小的75％～105％)的DNA分子。因此，λDNA只能作为小片段外源DNA分子(即2．5kb左右)的克隆载体。这一克隆容量显然不能满足大多数基因克隆工作的要求，必须对野生型λDNA进行改造。

扩充λDNA载体的克隆容量是改造λDNA的首要目标；此外改造工作还包括：①除去裂解周期所必需的基因区域中的限制酶识别位点，在非必需区引入合适的限性酶位点；②引入适当的选择性标记以方便重组子的筛选；⑧通过在某些必需基因中引入无义突变使之成为安全载体，以利于生物学防护等。

（2）载体类型：

只具有一个限制酶位点可便于外源DNA插入的称为插入型载体，含有二个限制酶切点，在两个位点之间的DNA区段可以被外源DN***段所取代的载体称为取代型载体。

随着体外包装技术和寡聚核苷酸合成技术的发展，人们已经构建了许多带有多克隆位点的λ噬菌体载体，现在常规使用的λ噬菌体载体，不少既可用作插入型又可用作置换型。总之，多克隆位点的引入不仅极大地扩展了λ噬菌体的克隆范围，同时还大大地简化了其操作技术。

（3）重组体的筛选

λ噬菌体是利用插入失活或噬菌斑形成的原理筛选重组体的。常用的插入失活方法有大肠杆菌β—半乳糖苷酶失活和免疫功能失活两种。

利用β—半乳糖苷酶插入失活的载体(如λgt ll、λgt l8—23等)，在生色底物(X—gal)和诱导物(1PTG)存在时，与相应的Lac—宿主铺平板可形成深蓝色噬菌斑。用这种载体进行克隆时，β—半乳糖苷酶基因的大部分被外源DN***段取代，所产生的重组噬菌体丧失α—互补能力，在含有X-gal和IPTG的平板下形成无色噬菌斑。因此，对于这类入噬菌体载体，可通过组织化学方法进行重组子的筛选。

在免疫功能插入失活型载体的基因组中与免疫功能有关的DNA区段中含有一、二种限制酶的单一切点，当外源DN***段由这些位点插入时，就会使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭到破坏，而无法进入溶源周期。因此，凡带有外源DN***段的重组体只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本则形成混浊的噬菌斑，不同的噬菌斑形态可作为筛选重组体的标志。这种类型的载体中的λgtl0最为常用。

3．λ噬菌体载体的应用

λ噬菌体作为克隆载体主要用于：

（1）基因组DNA文库的构建；

（2）cDNA文库的构建

（3）大容量载体(如粘粒等)中增殖的大片段外源DNA序列的亚克隆等。

四、 粘粒载体（柯斯质粒载体）

1．柯斯质粒载体的构建

λ噬菌体克隆外源DNA的能力，虽说其理论上的极限值可达23kb，但事实上较为有效的克隆范围仅为15kb左右。当然，在一般的情况下，这样大小的DN***段已足够容纳一个完整的基因及其两端的侧翼序列(flankingsequence)。然而，大量的研究资料表明，许多基因的分子大小比正常预期的要大得多，有的可达35～40kb甚至更大。同时，应用λ噬菌体作载体，还往往不能够同时克隆两个连锁的基因。不言而喻，在实际的研究工作中，特别是有关真核基因的结构与功能的研究，需要比λ噬菌体载体具有更大克隆能力的新型的载体。1978年，J．Collins及B．Hohn等人发展出的柯斯质粒载体(eosmidvectors)满足了这样的需要。

“cosmid”一词是由英文“cos site-carrying plasmid"缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点(cos)的质粒。因此我们说，所谓柯斯质粒，乃是一类由人工构建的含有且DNA的COS序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。它们兼具有λ噬菌体的高效感染能力和质粒易于克隆选择的优点，既能像质粒一样在寄主细胞内复制，也能像λDNA一样被包装到噬菌体颗粒中去。其克隆能力为31—45kb，而且能够被包装成为具有感染性能的噬菌体颗粒。

2．柯斯质粒载体的特点

目前已经在基因克隆通用的质粒载体的基础上，发展出了许多不同类型的柯斯质粒载体，柯斯载体的特点大体上可归纳成如下三个方面：

第一，具有λ噬菌体的特性。柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对立噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。进入寄主细胞之后的柯斯质粒DNA分子，便按照λ噬菌体DNA同样的方式环化起来。但由于柯斯质粒载体并不含有且噬菌体的全部必要基因，因此它不能够通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒。

第二，具有质粒载体的特性。柯斯质粒载体具有质粒复制子，因此在寄主细胞内能够像质粒DNA一样进行复制，并且在氯霉素作用下，同样也会获得进一步的扩增。此外，柯斯质粒载体通常也都具有抗菌素抗性基因，可供作重组体分子表型选择标记，其中有一些还带上基因插入失活的克隆位点。例如，在pHC79柯斯质粒基因组的PstI限制位点克隆，会导致ampr基因的失活；在BamHI和SalI限制位点克隆，又会造成tetr基因的失活。

第三，具有高容量的克隆能力。正如上面所述，柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点，一两个选择记号和COS位点等三个组成部分，其分子量较小，一般只有5～7kb左右。因此，可以插入到柯斯质粒载体上并能被包装成立噬菌体颗粒的最大外源DN***段，即柯斯质粒载体的克隆极限可达45kb左右。这个数字比且噬菌体载体及质粒载体的最大克隆能力都要大得多。同时，由于包装限制的缘故，柯斯质粒载体的克隆能力还存在着一个最低极限值。如果用作克隆载体的柯斯质粒的分子为5kb，那么插入的外源DN***段至少得有30kb长，才能包装形成具感染性的且噬菌体颗粒。由此可见，柯斯质粒克隆体系用于克隆大片段的DNA分子特别有效。

目前，已有多种柯斯质粒载体可用于基因克隆，图所示为最常用的柯斯质粒载体之一pJB8。

粘粒载体功能与λ噬菌体类似，但由于λ噬菌体具有较大的多功能性和较高的克隆效率，仍然是目前构建基因文库时首选的克隆载体，粘粒载体只有在以下两种特定的情况下使用：①在单个重组体中克隆和增殖完整的真核基因；②克隆与分析组成某一基因家族的真核DNA区段，即当载体克隆容量大具有明显优势时使用粘粒载体。

我查的

质粒是目的基因的运载体
在用鸟枪法或人工合成法提取目的基因后
用限制性内切酶将质粒切开，使目的基因与切开的质粒具有相同的粘性末端
他们的碱基恰好配对，氢键自动结合
再用DNA连接酶将切口补上
重组质粒就形成了。

原先的质粒可看作是一个环 现在环上用限制酶切一刀 将目的基因插入 目的基因两端再用DNA分子连接酶与原先质粒环上的切口的粘性末端连接上 重组质粒就形成了