如何检测蛋白表达量的升高或降低

植物油体表达体系的研究进展
刘昱辉、贾士荣**
中国农业科学院生物技术研究所,北京100081
摘要：介绍了植物种子中油体和油体蛋白（oleosin）的结构特征及其编码基因的调控,阐述了用植物油体表达体系这一新型植物生物反应器生产目的蛋白的研究进展和前景.
关键词：油体；油体蛋白；表达体系；植物生物反应器；目的蛋白
现有外源基因表达系统主要包括：细菌、丝状真菌、酵母、哺乳动物细胞、动物乳腺、昆虫（昆虫细胞、昆虫杆状病毒和昆虫整体）和植物表达系统（植物整体、病毒载体和油体）等.这些外源基因表达系统在表达量、表达产物的分离纯化及活性、成本等方面各有优缺点.从近年的研究进展看,利用植物表达系统大规模生产各种目的蛋白还受到诸多因素的限制,表达量低、提取和纯化成本高是主要的限制因素.植物油体表达体系将目的蛋白的编码基因插入油体蛋白（oleosin）编码基因的3`端,以oleosin启动子驱动目的蛋白与oleosin一起在转基因植物的油体中特异表达,获得转基因植物种子后,将种子粉碎, 利用油体的疏水性,离心将油相和水相分开,回收上层油体部分,即可去除种子中大部分的非目标成分,从而显著降低目的蛋白的分离纯化成本,因此近年来倍受关注.作为一种新型的植物生物反应器,为最终利用转基因植物生产外源蛋白提供了新的途径.
1 油体（oil body）
植物种子中贮存的营养物质主要包括蛋白质、脂肪和碳水化合物.其中脂类物质一般以三酰甘油（triacylglycerols,tag）的形式存在,荷荷芭（jojoba）例外,它贮存蜡酯（wax esters）.种子中的tag分子之间不是彼此聚合的,而是分散成许多小的稳定的亚细胞微滴,被称为油体.油体作为生物体中最小的细胞器有其自身的结构和特征.
1.1 油体大小
油体为直径0.5-2.5μm的球体,其大小因植物种类的不同而不同,且受营养和环境的影响.即使同一粒种子,不同组织中的油体大小也不相同.从生物学角度讲,油体的大小主要决定于两个因素：（1）种子发芽时为脂酶催化tag提供最大的作用表面；（2）消耗最少量的油体蛋白和磷脂（phospholipids, pl）.如果油体的直径小于0.2μm,虽可为脂酶的催化提供更大的作用表面,但却需耗费大量pl和oleosin.相反,如果油体直径大于2.5μm,虽节省了pl和oleosin的用量,但由于作用表面过小,在种子发芽及幼苗生长时,脂酶不以迅速水解脂类为植物提供生长所需的能量.
1.2 油体成分
油体的成分包括：（1）92%-98%的中性脂类：主要为tag,约占95%,少量的二酰甘油（dag）和自由脂肪酸；（2）1%-4%的磷脂（pl）：主要为磷脂酰胆碱,约占60%-70%,少量的为磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇；（3）1%-4%油体蛋白：其中90%为oleosin,少量的为caleosin、细胞色素c还原酶等.某些植物（如蓖麻和大豆）成熟种子的油体膜上还有脂酶和酰基脂酶存在.花粉粒油体中未检测到oleosin,橄榄和鳄梨果实中皮层油体中也没有oleosin.由于这些油体中的脂类物质不是用于长期贮存,因此murphy和vance提出oleosin可能仅为储藏器官油体所特有,但næsted等发现根尖油体中有oleosin存在.
1.3 油体的基本结构
根据tzen等提出的油体结构模型,油体内部为液态tag,外部是由单层磷脂分子及其镶嵌蛋白-oleosin组成的半单位膜,这个半单位膜的基本单位是由13个pl分子和1个oleosin分子组成（图1）.pl占油体表面的80%,其余20%是oleosin.每个pl分子的2个疏水酰基朝向内部疏水的tag基质,与tag分子相互作用；pl亲水的头部基团朝向胞浆.oleosin分子中间的疏水区域形成一个约11nm的柄状结构占oleosin分子的2/5,伸入pl的疏水酰基部分及油体内部的tag中,该部分为由68-74个氨基酸组成的发夹结构,发夹结构的顶端是由3个脯氨酸和一个丝氨酸构成的“脯氨酸结”（图1）.oleosin分子其余的3/5部分则覆盖在油体表面,阻止外部的磷脂酶作用于磷脂半单位膜.等电聚焦结果显示,油体的等电点为5.7-6.6,即在ph值为中性时,油体表面带负电荷.植物种子经长期贮存,油体结构仍保持稳定,彼此之间不会相互聚合,普遍认为油体表面电荷和oleosin蛋白的存在是维持油体结构稳定的主要因素.最近的研究结果显示,油体表面除主要镶嵌有oleosin外,还镶嵌少量其它蛋白,如caleosin,因此油体作为植物中最小的细胞器,其结构可能较上述模型更加复杂.oleosin和caleosin是迄今为止研究得较多的两种油体蛋白.
2 油体蛋白
2.1 oelosin及其结构特点
oleosin最早是从芥菜中发现的,目前许多种植物（如芝麻、油菜、向日葵、胡萝卜、玉米、大豆、拟南芥和棉花）的oleosin基因序列和氨基酸序列均已报道.oleosin是高度疏水的碱性小分子量蛋白,分子量为15-26kd,主要在种子中特异表达.一般认为oelosin为油体所特有, 最近发现约有5%的oelosin存在于靠近油体的内质网上,另外在根尖油体中也发现有oelosin存在.oelosin是在内质网上合成的,由与内质网结合的核糖体负责合成.oelosin镶嵌在油体表面,对维持油体的稳定极为重要,一方面在空间上阻碍油体分子间相互聚合,另一方面在种子发芽时,oleosin被认为是脂酶与油体间的结合位点.某一植物中含量最高的oleosin的抗体也能识别同科植物中分子量相近的oleosin,如十字花科的19-20kd、菊科的20kd和豆科的24kdoleosin；不仅如此,不同科间的oleosin也可发生这种交互反应.
不同植物来源的oleosin蛋白具有相同的结构特性,都具有3个基本的结构域,即（1）n端40-60个氨基酸组成的两亲性区域（兼具亲水性和亲脂性）.这一区域分布于油体朝向胞浆的一面.（2）中间68-74个氨基酸组成的高度疏水区域.tzen和huang根据这一区域中氨基酸残基极性的分布,推测其为伸入tag基质中的反式平行的β-折叠结构,其顶部具有由3个脯氨酸和1个丝氨酸组成的“脯氨酸结”.这一区域尤其是“脯氨酸结”在不同来源的oleosin中高度保守,因此从进化上讲,该区域可能对植物有重要意义.（3）c端的33-40个氨基酸组成α-螺旋结构域.该结构域兼具亲水和亲脂性,其带正电荷的基团朝向pl层带负电荷的部分（磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、自由脂肪酸等）,带负电荷的部分朝向油体表面（图2）.对每个oleosin蛋白分子而言,约20%的氨基酸残基镶嵌在pl层上,30%浸在tag中,其余50%暴露在油体表面.对oleosin二级结构进行的生化分析支持tzen的这一模型.lacey等提出新的oleosin二级结构模型：即oleosin中部疏水区域是由“脯氨酸结”连接的两个分开的α-螺旋结构,并由这个“脯氨酸结”形成180度转角；n端为β-折叠结构；c端是兼具亲水和亲脂性的α-螺旋结构,上述两种模型均有待进一步的实验验证.
2.2 oleosin基因及其表达调控
研究发现裸子植物中只有一种oleosin,被子植物中的oleosin基因常以基因家族的形式存在,一种植物中常有几个oleosin异构体（表1）.各异构体在植物中的表达量、表达部位及表达速度均不相同.如玉米中18kdoleosin的表达量仅为16kd的10%-20%,油菜油体中24kdoleosin仅为20kd的10%.
oleosin基因表达调控的特点：
（1）oleosin基因主要受发育调控,在种子成熟过程中表达.oleosin基因受水分逆境、茉莉酮酸、aba和渗透稳定剂（如山梨糖醇）诱导表达,如油菜的20kdoleosin基因受aba诱导后0-4h检测到mrna和蛋白质积累；渗透稳定剂（如山梨醇）处理1h可测到mrna,3-6h检测到oleosin蛋白的积累.在油菜和拟南芥oleosin基因的启动子区均存在abre（aba-responsive element）基元序列（t/c acgtggc）,特异地受aba诱导.（2）oleosin基因的表达具有组织特异性,主要在种子的胚（盾片和胚轴）及糊粉层中表达,de-oliveira等、robert等报道在花粉中发现有一类特殊的oleosin.油菜小孢子培养来源的球形胚和心形胚中可测出20kd的oleosin,心形胚中可测到相应的mrna,说明oleosin在种子发育的早期就有表达.（3）oleosin基因5`端上游区域还具有其它调控序列,如在水稻oleosin基因上游存在谷物贮藏蛋白基因的调控元件catgcang.油菜oleosin启动子上存在的aatgcatg序列,与控制豆科植物基因种子特异表达的保守序列ry基元序列（catgcatg）高度同源.拟南芥oleosin基因启动子上存在豆科植物种子蛋白普遍具有的caca（taacaca）序列.（4）oleosin基因虽为组织特异表达,但其5`端却没有信号肽序列存在,与此相应的是oleosin蛋白n端也没有剪切信号序列,推测oleosin基因内部可能有某些序列,或者oleosin蛋白能够形成某种构象使其定位到油体表面,例如oleosin中部缺失,严重影响其在油体上的定位,而n端或c端缺失则影响较小或根本无影响.“脯氨酸结”中的3个脯氨酸突变为亮氨酸的实验,证明“脯氨酸结”为oleosin定位于油体所必须.oleosin中部疏水区域可能是oleosin的内质网定位信号,但在体外实验中,“脯氨酸结”突变不影响oleosin内质网上的定位.
2.3 caleosin
用不同方法分离多种植物油体蛋白,发现除oleosin外,还含有少量其它蛋白.1998年chen等首次以免疫标记法确定了芝麻油体中的另外3个种蛋白sop1、sop2和sop3.sop1经氨基酸序列测定,发现它与水稻的一个钙结合蛋白同源,因此将这类蛋白命名为caleosin. caleosin在高等植物中广泛存在,藻类和真菌中也有类似蛋白.不同来源的caleosin表达特性不同.如水稻caleosin主要在胚形成后期表达,受aba或水分逆境诱导可在幼苗和营养生长组织中表达.与水稻caleosin水同,芝麻caleosin似乎仅为种子特异表达.干旱状态下,拟南芥受aba诱导可检测到caleosin同源蛋白mrna.已知高等植物caleosin蛋白分为3个结构域：（1）n端亲水区,含有一个与ca2+结合的ef-hand.大肠杆菌中表达的ef-hand融合蛋白,在体外实验中可与ca2+结合.从芝麻油体中分离得到的caleosin1也能与ca2+结合.（2）中部疏水区,该区包括n端的一个胞外膜定位区和与之相邻的一个富脯氨酸区.已知这一结构仅存在于某些高等植物如芝麻、水稻和拟南芥的caleosin.（3）c端亲水区.多数植物caleosin的c端亲水区一般都包括4个激酶磷酸化位点.不同来源caleosin的结构和生物学功能尚不清楚,推测可能参与油体生物合成、脂类的胞内运输和代谢.
3 植物油体表达体系
3.1 oleosin目的蛋白表达载体的构建
如前所述,所有oleosin均有3个结构域,3个结构域加起来约15kd,但oleosin分子量的判别却很大（15-26kd）,多出的1-11kd以c-端或n-端的延伸形式存在.不同来源的oleosin除中部疏水区域高度保守外,n端和c端核苷酸序列差异很大.这使人们想到,将外源小分子量蛋白编码基因插入oleosin基因的5`端或3`端,构建由oleosin启动子驱动的“oleosin目的蛋白”植物表达载体,转化受体植物,不会影响oleosin在植物油体上的定位.由于oleosin为种子特异表达,并镶嵌在油体表面,目的蛋白在转基因植物中是以融合蛋白的形式与oleosin一起在油体中特异表达.
3.2 植物油体表达体系的优点
3.2.1融合蛋白易于分离 oleosin为种子特异蛋白表达,并镶嵌在油体表面.外源基因插入oleosin的n端和c端,构成融合蛋白并未改变oleosin的特性.因此利用油体亲脂疏水的特性,将转基因植物种子经粉碎→液体抽提→离心处理,回收上层油相即可将融合蛋白与细胞内其它组分分开,可去除90%以上的种子蛋白.当融合蛋白中插入的目的蛋白为酶时,oleosin-融合蛋白可直接作为酶使用,酶催化反应结束后还可回收,用于下一次酶促反应（作为固定化酶）,一般重复使用2-3次后,仍保持较强的酶活力.若融合蛋白不具活性,则需将目的蛋白从oleosin上切下来.为此,需在目的蛋白和oleosin基因之间引入一个蛋白酶酶切位点,比较常用的是溶血酶（thrombin）,融合蛋白经酶切后,再设法将两者分开.
3.2.2融合蛋白在种子中可长期稳定贮存 成熟种子中水解酶活性降低,因此融合蛋白可在种子中长期稳定贮存而不会被降解.据van rooijen和moloney报道,oleosin-gus（β-葡糖醛酸苷酶）融合蛋白在转基因油菜种子中4℃贮存1年以上,也不降解.
3.2.3种子易于运输,有利于工业化生产 种子成熟过程中95%以上的水分被蒸发,较植物的其它部分更易于运输,为大规模生产目的蛋白带来方便.
3.2.4现在加工机械适用于种子粉碎和油体的分离 例如谷物的加工粉碎用水磨,而乳制品工业中用于分离奶制品的设备可用于液体抽提后油体的离心分离.
3.2.5增加农产品的附加值 分离目的蛋白后的油体仍可作为食用油或工业用油,目的蛋白则可大大增加农产品的附加值.
3.3 用植物油体表达体系已表达的外源蛋白
1991年lee等首次报道将玉米的oleosin基因转入油菜,玉米oleosin的mrna仅在转基因植物成熟种子中存在,表达量为种子总蛋白的1%,表达产物90%定位在油体上.单子叶植物玉米的oleosin基因在转基因油菜油体上的正确转录、翻译和定位,说明单子叶来源的oleosin基因上有足够的信息可以使它在双子叶植物中起作用.1996年holbrook等用基因枪轰击油菜种胚,在短暂表达检测中发现oleosin-gus融合蛋白在油体上正确定位,进一步验证了lee等的实验结论果.vanrooijen和moloney将gus基因插入拟南芥oleosin基因的3`端,构建以oleosin启动子驱动的植物表达载体,以农杆菌介导法转化油菜,在转基因植株中80%的gus活性在油体上.该实验还发现oleosin-gus融合蛋白本身就具有β-葡糖醛酸苷酶的活性,而不必将gus从oleosin上切下来.由于融合蛋白结合在油体上,因此可作为固定化酶多次重复使用.1995年parmenter等构建了由拟南芥oleosin启动子驱动的oleosin-水蛭素融合蛋白表达载体,转化油菜,经免疫荧光检测,融合蛋白定位在油体表面,表达量占种子总蛋白的1%.将水蛭素与oleosin蛋白酶切分离后,得到具有生物学活性的水蛭素.该实验发现虽然oleosin-gus融合蛋白具有生物学活性,但oleosin-水蛭素融合蛋白却没有水蛭素特有的抗凝血酶活性,必需将其从融合蛋白上酶切下来.1997年liu等利用植物油体表达体系在转基因油菜中成功地表达了来自瘤胃真菌的木聚糖酶.
3.4 受体作物和目的蛋白的选择
受体作物应选择油脂含量高、遗传转化容易的作物.目的蛋白的选择应考虑：（1）分子量不宜太大,以防影响融合蛋白在油体表面的正确定位.目前利用油体表达的目的蛋白最大的是67kd的gus；（2）目的蛋白应有一定的亲水性,尤其当需将目的蛋白从融合蛋白上切下时；（3）功能清楚,基因序列已知；（4）价格昂贵,有良好的商业价值,可显著提高农产品的附加值.
基于以上考虑,我们实验室选择以油菜、棉花为受体.为研究植物油体表达体系的适用性,我们选择以c端需酰胺化才有生物学活性的降钙素作为目的蛋白,目前已获得转基因棉花第4代株系和转基因油菜植株.转基因油菜经pcr检测,证明降钙素基因已整合到油菜基因组中.转基因棉花经pcr-southern和western检测,证明目的基因已在棉花中整合并在油体中表达.转基因植株中目的蛋白的表达量和生物学活性检测正在进行中.“一种新型鲑鱼降钙素类似物及利用植物油体表达体系生产外源蛋白的方法”已申请国家专利（另文报道）.
4 前景和问题
用油体表达体系成功地表达gus、水蛭素、木聚糖酶、降钙素等外源蛋白,尤其是与固定化酶技术结合,无疑使人们看到了其在工业化生产目的蛋白方面的应用前景,但作为一种新型植物生物反应器,还有许多问题需要进一步的研究和探讨,包括：（1）如何进一步提高蛋白表达量和降低目的蛋白的分离纯化成本.当oleosin-融合蛋白不具生物活性时,这一问题就更加突出,目的蛋白酶切、分离和纯化成本高,将严重影响这一体系的实际应用.（2）已知有些蛋白糖基化、酰胺化后才具有生物活性,油体表达体系中目的蛋白能否糖基化和酰胺化以及糖基化、酰胺化程度如何,还有待更多的实验研究.油体表达体系的局限性还表现在对目的蛋白的分子量、亲水和疏水性有一定的要求.没有一种表达体系是万能的,如何扬长避短,充分利用不同表达体系的优点,表达适当的目的蛋白以造福人类,这是今后需要深入研究的课题.