DNA聚合酶链式反应的PS:

2025-03-25 23:04:10

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回答1：

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction ,PCR）
三步：
1 变性：模板DNA加热变性
2 复性引物与它的靶序列发生退火，引物DNA量多，使引物和模板在局部形成杂交链
3 延伸 4种dNTP 与 Mg2+ 存在的条件下，DNA合成酶催化以引物为起始点，按5'-3'方向进行延伸。
上面三步为一个循环，可使拷贝数到达2*E－6-2*E－7
PCR 产物一段双链DNA，是由它的末端引物的5’端决定的。
1.首轮扩增，其产物是大小不均一的DNA分子。长度应大于两引物之间的长度。
在第二个循环中，如图3，由于5'固定，其产物长度就由等于两引物之间的长度。所以几十个循环后就会产生大量的两引物之间序列。
引物设计：
1，长度15~30个核苷酸，最多到50个核苷酸左右。（50？为什么？反正太长也没有必要）
2, 尽量避免嘌呤和嘧啶堆积的现象。（其实有时很难避免，不是很重要）。
3,引物内部不应该形成二级结构，如果引物中有酶切位点时，就会出现引物二聚体。（一般不是很重要）
PCR的反应条件
1，dNTP浓度过高会加快反应速度，但同时还可以增加碱基的错误掺入率。
2，引物浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增。
3，TaqDNA聚合酶浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增，低则合成产物量减少。
TaqDNA聚合酶无校正功能，掺入错误率达2*E-4个核苷酸，一个30个循环的扩增反应0.1%-0.25%总错误率。
4，在90～95度下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94～95度30～60s。时间过长使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破坏增多。
5，DNA很快冷却到40～60度使引物和模板结合。引物长度在15～25时退火温度
Tm=4（G+c）+（A+T），一般在45～55度，温度低容易退火但特异性低；温度高，不容易退火但特异性高。退火时间30秒。
6，延伸温度一般在70～75度这时TaqDNA聚合酶活性最高（150个/S），当引物在16个碱基以下时可采用缓慢升高温度到70～75度的方法，使在低温下就开始合成。一般<1KB时间1分钟即可。当〈1KB时在较后的循环中延长扩增时间。
7：循环次数25～30次。
无产物时：
1，取10ul扩增混合液作模板在进行PCR扩增。
2，增加TaqDNA聚合酶浓度
3，增加循环次数
4，降低退火温度
5，加靶DNA量

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