蛋白marker为什么能作为显色条带

2025-03-24 17:54:11

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回答1：

蛋白marker可分为：一、未预染的Marker即宽分子量蛋白标准、高分子量蛋白标准以及低分子量蛋白标准;二、预染的Marker即单色预染和多色预染。

在western Blot过程中，分子量Marker就像个螺丝钉一样没虽然是个小细节，然而就是这样一个小细节对实验结果有着不可忽视的作用。这个 Western Blot参照家族的一员的作用主要是用来指示蛋白条带所对应的分子量大小，只有标准量精确无误了，实验结果才有说服力，除此之外，蛋白标准还有表示转移成功或者蛋白在凝胶上的电泳程度等等的作用，所以选择正确的蛋白Marker也是western blot实验成功的必要条件之一。

总体来说，蛋白分子量标准可以分成未染蛋白分子量标准、预染蛋白分子量标准二个级别。以下是关于蛋白分子量标准的小叙：

一. 未染色(pre mixed)蛋白分子量标准

未染色的蛋白分子量标准是最简单，也是最准确的一种。由于没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，是精确判断蛋白大小必须的。现在的marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋白比较。预混的Marker通常有几条带加倍浓度作为指示，因为混合的条带越多，越不好记，谁知道哪条是那条!数到眼都花了。所以当看到特别浓的那几条标志带就记得是哪里了。不过要记得，小带通常都不那么容易看清楚的。在选择上来说，当然是选择其中至少有一条条带和自己的目的蛋白大小相近的最好，越近越好。如果你的蛋白不幸在两条跨度较大Marker条带之间，选别的Marker吧。预混的Marker使用上不如预染Marker(pre-stained)好用，因为电泳过程中完全看不到，要和目标蛋白一起等到最后染色才“开蛊”，无法对实验起预示参照作用。完全属于“后知后觉”型的，当然还是比“不知不觉”不做对照的要好。

① 宽分子量蛋白标准

如果从实验室总体考虑的，就选范围尽量宽，条带分布比较均匀的，这样你的蛋白无论在哪个区间都容易判断，避免正好落在一段空白区的危险。不过条带越多，每次上样量也就越费。拿到Marker后，如果买的是大包装，就应该考虑分装。多次反复冻融对于蛋白的危险，不用多说吧。另外要记得，宽谱的Marker不一定每条都能看到的，特别是Mini Cell。如果侧重大蛋白，那小的可能就已经跑掉了，不是质量不好哦。

② 高分子量蛋白标准

通常在检测大分子量蛋白经常使用到高分子量蛋白标准，

③ 低分子量蛋白标准

在一般的蛋白电泳当中，更常用的是低蛋白标准分子量，除了有指示蛋白大小的作用以外，有时还可以用作粗略的定量。实验室用在一般蛋白电泳的低分子量蛋白标准中。

在低分子量蛋白标准这里还包括可特别小的蛋白标准，比如30kD以下蛋白或者多肽的分离辨别。其中GE的从2kD到16kD之间有6条带的蛋白标准挺不错，另外提醒一句，特别小的蛋白Marker条带如果要显色好，上样一定要上足够的量哦。

二.预染蛋白分子量标准

预染蛋白分子量是一些纯化好的蛋白混合物，通过与染料共价耦联，在电泳过程中或者转膜时可以直接观察到。预染蛋白分子量的出现方便了我们的实验，这种蛋白分子量标准可以帮助我们在电泳时、电泳后，以及转膜后监测电泳情况和估计迁移率——比如，已知垂直电泳最佳分辨区域大约在胶的2/3处，如果使用预染Marker就可以预测目标蛋白进入最佳分辨区时停止电泳以得到最佳分辨效果;如果观察到Marker电泳异常也可以及时终止电泳;另外在Western Blot转膜以后可以直接观察蛋白转膜是否完全，还可以在膜上标记蛋白分子量，所以吸引了许多实验室人员购买预染蛋白标准。值得注意的是预染蛋白Marker与染料共价耦联，所以在不同的缓冲条件下电泳时迁移特性可能会发生某些变化，可能导致一些偏差，所以不太适合精确定位蛋白——不过多数情况下Marker的条带未必能和我们的目标蛋白完全一样，我们得到的也不过是一种相对Marker指示的参考大小，最后都需要Western来定性，所以如果不是要区分大小相近的条带，预染Marker还是很好用的，而且也可以和未染色的蛋白标准一起使用。

预染蛋白标准可以分为两种：单色预染和多色预染，其实区别就在于帮助在实验过程中辨认某个条带的大小——Marker条带越多参考价值越大，可就越难辨认区分，如果用不同的颜色来区别就比较好辨认啦。如果沉闷的电泳实验中跑出五颜六色的彩虹Marker，此时心情想必会愉快一些!单色的Marker通常是利用其中某些条带加倍浓度来提示其大小的。还有一点特别要注意，由于转膜是一个将胶里的Marker浓缩在洁白的膜上，所以需要的上样量相对少一些，如果想要在电泳过程中看到美丽的“彩虹”，或者单色的Marker往往需要比说明书里多加一些Marker的。

三、Western专用的蛋白分子量标准

①生物素标记蛋白标准

未染色的Marker在做Western时，需要在印迹前先用丽春红或者是SYPRO荧光蛋白染色液等不干扰Western Blot的染色方法显色，在胶上做标记最后才能“拼”在最后的结果中，如果是预染的Marker就要在转膜后标记膜，或者剪膜，最后在“拼上”。要是想直接将Marker结果显示在最后结果上，不用手工作图或者拼接，那就要Western专用的Marker了。比如生物素标记的蛋白标准。这种方法主要是配合化学发光法：在蛋白分子量上标记生物素，通过带有抗生物素的抗体或者偶联链亲霉素的抗体，在化学发光检测到目的蛋白带时就可以同时看到相应的分子量标准一起发光显影了。不同于普通蛋白分子量标准的便宜、预染蛋白分子量的方便，这一方法的优点是与Marker和目的蛋白对应性好，同时在同张片上显示，不用拼接，利于分析。缺点是如果样品中带有生物素背景，那个抗生物素抗体有可能影响结果，而且反应体系太过复杂也会干扰实验结果。

②特殊标记蛋白标准

在经过修饰的蛋白标准中，除了生物素标记以外，近些年由于下游蛋白操作的丰富化与复杂化，也出现带有“尾巴”的蛋白标准。比如His-Tag，如果每个Marker条带都有His –tag，那二抗添加His-Taq抗体很容易将Marker条带显示在Western结果上。很方便，问题就是有可能有潜在的干扰，比如样品中正好有类似Histag的结构。不过这可以通过对照检测的。

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