PCR复性温度如何确定

2024-12-03 00:27:09
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回答1:

延伸温度根据你使用的Taq来确定就好了,一般都在70度上下,嫌麻烦就定个70度长期使用。你买的taq的说明书上会给你建议的温度。
退火的温度定在55度就ok了,万年不变也没有关系, 50度到60度都差不多。这个说明书也会给。
变性95度上下几乎万年不变。
最后延伸是为了把没有延伸完的片段(如果有)补全。一般4分钟以上都ok。
非特异性扩增产物看你的引物设计的好不好,设计的好就不太会有。
引物二聚体也是,注意设计的引物的二聚体绝对不能在末端配对成功,这会大大降低引物的效率。
二聚体几乎不可避免,所以PCR完成之后,立刻跑个胶,切胶回收就好了,这样二聚体就不会被回收回来,非特异性产物也会减少很多。

回答2:

最后延伸10min是为了确保在循环过程中没有延伸完全的产物在这一步骤得到充分延伸
如果有非特异性产物,可以适当提高退火温度,增加特异性,或者采用巢式PCR,即回收部分纯的PCR产物作为模板进行第二轮扩增