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为啥egfp报告基因能检测转基因是否成功
做小鼠胚胎发育的研究人员一般喜欢用LacZ,也就是将LacZ置于一个启动子的调节之下.用LacZ可以进行胚胎全身染色(whole body staining),这样可以了解一个基因在体内的表达谱全貌.如果做细胞跟踪,比如免疫细胞,神经细胞等,一般喜欢用荧光蛋白.这样一是容易对细胞进行分离(比如FACS)和体外分析,二是容易对分离的细胞进行体内追踪(比如Adoptive transfer).早些年用的最多的是EGFP和EYFP.有的时候,我们需要将两种不同的reporter小鼠交配在一起,研究两个基因的关系,这时可以将两个基因采用不同的荧光蛋白进行标记,也就是做两种不同的模式小鼠.因为早期大家多是用EGFP,现在可以多做一些其它荧光蛋白的报告基因小鼠,以便跟以前研发的EGFP小鼠结合起来研究.zsGreen和EGFP,EYFP都是绿色荧光.EGFP和EYFP很难区分开.zsGreen是一个比较稳定的绿色荧光蛋白.DsRed和TdTomato都是红色荧光.这两种荧光蛋白都有报告基因模式小鼠发表.TdTomato是一个信号非常强的荧光蛋白,目前已经有报告基因小鼠发表,对细胞/小鼠也没有明显的毒性.相信以后会有越来越多的小鼠用TdTomato来做报告基因.虽然mRFP和mCherry是两个非常好的荧光蛋白,但由于它们需要584nm的激发光,所以一般的FACS仪器不能检测到信号,需要用到LSRII这样的仪器,而很多实验室可能没有这样的仪器.也有用EBFP,ECFP做细胞实验的,但用到小鼠上的比较少.比如需要用到紫外光来激发.如果想在一个小鼠里表达两种荧光蛋白,最好是用两种分得比较开的,比如,最好不要同时用EGFP和EYFP.\x0dHuCD2和Thy1.1是细胞表面受体.HuCD2因为去掉了C-term序列,使得其失去了信号传导的功能.那什么时候会用这两种分子呢?比如我们想研究一个细胞内蛋白基因(比如转录因子)的功能,经常需要把表达这个蛋白的细胞分离纯化出来.这个时候可以将HuCD2或Thy1.1报告基因放置在这个细胞内蛋白基因启动子下(比如加一个IRES-Thy1.1),这样所有表达这个细胞内蛋白的细胞都会在细胞表面表达Thy1.1.这样就可以用anti-Thy1.1抗体将这一群细胞分离出来,进行后续研究.当然也可以用anti-Thy1.1抗体进行组织切片的免疫荧光检测.\x0dHA、FLAG、Biotin等是细胞和生化实验中常用的标签多肽或蛋白.在Western blot,免疫沉淀(Immunoprecipitation)等实验中经常用到,因为有非常特异的HA、Flag抗体.Biotin可以跟生物素(Streptavidin)直接结合并用于免疫沉淀.在模式小鼠中,这些标签多肽或蛋白可以与要研究的蛋白做成融合蛋白.这种模式小鼠最常被用到的是Chip-chip实验.比如要研究一个转录因子的功能,就需要知道这个转录因子在细胞内(正常或刺激条件下)结合到染色体基因组DNA的位置以及结合序列.我们知道,特异性好、亲和力高的抗转录因子的抗体非常不容易得到或制备.这个时候可以将标签多肽(比如FLAG)放在转录因子的C-term,做成融合蛋白.刺激细胞之后,对细胞进行化学交联,并破碎细胞以及基因组DNA,然后用anti-FLAG抗体作免疫沉淀,将转录因子沉淀下来.最后分析这些转录因子所结合的DNA片段序列,从而找到该转录因子的在基因组上的识别序列,也就找到了该转录因子的作用基因.\x0d荧光素酶做报告基因模式小鼠,一般是为了做活体成像实验.比如在一个细胞因子启动子下面放置荧光素酶基因.免疫小鼠之后,有些细胞或器官表达该细胞因子同时表达荧光素酶.通过注射荧光素酶底物可以检测荧光在小鼠体内的分布,从而得出该细胞因子在不同免疫条件下的表达情况.荧光素酶在癌症研究中也经常用.通过荧光活体成像可以研究肿瘤细胞的发生和转移.\x0d报告基因很多.这里只是一点简要的介绍.不同的模式小鼠根据实验目的不同,可以做非常不同的设计.
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